【逸芯生命科学】医工结合新成果 | 逸芯生命科学团队在国际著名期刊《ADV HEALTHC MATER》上发表异质性肿瘤微环境模型构建研究性论文

癌症发展一直被认为是一个复杂的变化和生态过程，其特征是癌细胞与肿瘤微环境（TME）之间持续、动态和各种交互的作用。这些相互作用对于肿瘤的出现和进展至关重要。癌症相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境中的关键基质细胞，影响癌症生长、血管生成和基质重塑。开发一种有效的体外3D肿瘤模型来准确模拟成纤维细胞介导的TME异质性、概括肿瘤和基质细胞之间的动态相互作用，可以深入探索TME在肿瘤发展和治疗耐药性中的关键作用。

 

此，逸芯生命科学首席科学家-中山大学生物医学工程学院刘杰教授团队与南方医科大学珠江医院普外科韩帅教授团队联合开发了一种高通量3D肿瘤细胞共培养模型，该模型采用生物3D打印技术来构建体外成纤维细胞介导的异质性肿瘤微环境（图1）。研究表明，利用3D打印技术构建的MRC-5（成纤维细胞）和MCF-7（乳腺癌细胞）的3D模型，可通过TGF β刺激下，完成正常成纤维细胞到CAFs 转化、EMT 转化、肿瘤球生长、迁移、基因表达变化和实现其他关键肿瘤微环境特征的体外重现。此外，评估了五种常见乳腺癌药物对这种异质性肿瘤模型的敏感性，突出了其高通量药物筛选的潜力。本研究概括了动态成纤维细胞-肿瘤细胞相互作用，建立了体外多细胞复杂肿瘤异质微环境，为阐明肿瘤发病机制和指导药物发现奠定了基础。

该研究详细过程及结果以“Bioprinted Fibroblast Mediated Heterogeneous Tumor Microenvironment for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Screening”为题于2025年1月22日发表于《Advanced Healthcare Materials》期刊上。

 

研究结果

高通量3D生物打印载细胞水凝胶微球

使用先前报道的脂肪脱细胞细胞外基质（adECM，逸芯生命科学 货号：YX-OG-2302-10）和GelMA（逸芯生命科学 货号：YX-GM-231121-01）作为复合生物墨水制造了水凝胶微球。细胞外基质材料保留了原始组织中的多种蛋白质和生物活性成分，与传统的水凝胶材料相比，它们更有利于支持3D细胞培养。结合3D生物打印技术可以有效地生产具有均匀尺寸、高重现性和可调节直径的水凝胶微球，为制备载细胞水凝胶微球提供了强大的平台。通过调节细胞生长微环境和增殖持续时间，实现了不同细胞类型之间增强的紧密细胞间连接。该3D微环境中成纤维细胞和肿瘤细胞的动态功能调节增强，从而更准确地模拟实体瘤中肿瘤细胞和基质细胞的微环境。

 

TGF-β在3D条件下诱导的CAFs转化

肿瘤细胞、正常成纤维细胞和CAF之间具有错综复杂的相互作用，其中TGF-β是一种重要的转化生长因子。在构建好的3D模型中添加TGF-β培养一周后，流式细胞术分析显示各种 3D 打印异质性肿瘤模型中有不同的α-SMA表达模式。与MRC组（MCF-7和MRC-5细胞）和MCRT组（MCF-7、MRC-5 细胞和TGF-β）相比，MC组（单独MCF-7细胞） 表现出α-SMA表达显著降。此外，F-肌动蛋白染色显示，3D培养条件下的CAFs表现出紧密的细胞间连接并形成成簇的树突状结构，而正常的MRC-5细胞表现出具有不同细胞间间隙的扩散模。这些结果表明在3D培养中成功构建了CAF 介导的异质性肿瘤微环境，有望为构建其他异质性肿瘤模型建立标准化技术平台。

成纤维细胞介导的异质性肿瘤微环境的形态学和组织学分析

培养7天后MCF、MCR和MCRT组中 MCF-7细胞和成纤维细胞的3D细胞形态结果表明，MCRT组表现出透明度降低，表明细胞密度更高，连接肿瘤球和成纤维细胞的网络结构很明显，且表现出更大的肿瘤球（白色箭头）和更密集的成纤维细胞簇（黄色箭头），表明这些细胞类型之间存在直接相互作用，CAFs和肿瘤球之间表现出更紧密的接触。该体外建立直接的CAF-肿瘤连接模型，与以前的共培养模型不同，并为成纤维细胞靶向肿瘤治疗的研究提供了基础平台。

成纤维细胞介导的体外EMT转化

EMT是肿瘤微环境中的一个复杂细胞过程，与早期肿瘤基质硬化、耐药和转移有着错综复杂的关系。深入了解其与肿瘤环境的相互作用对于避免肿瘤进展和复发以及改善预后至关重要。EMT过程通常涉及上皮标志物（如E-cadherin）的丢失和间充质标志物（如Vimentin）的增加。免疫荧光染色结果表明，MCRT组的HIF1-α和Ki-67表达显著高于其它组，这说明该3D肿瘤模型的乏氧环境和肿瘤增殖情况更为仿生，而E-cadherin的表达显著低于MC 和MCR 组，与MC组相比，荧光强度降低至 ≈30%。相反，MCRT 组的 Vimentin 表达显着升高，进一步强调了成纤维细胞在促进上皮-间充质转化（EMT）转化中的关键作用。

 

转录组测序分析

为了验证该3D肿瘤模型与传统模型的仿生度差异和基因表达模式差异，进一步进行了转录组测序分析，对比了2D MC（单层培养）、3D MC（3D培养）、MCRT（成纤维细胞介导的异质性肿瘤模型）的培养结果，MCRT组表现出最显着的效果。差异基因表达分析显示，487 个基因在2D和3DMC模型之间的表达水平发生变化，其中452个基因下调，35个基因上调（图 8C）。同样，MCRT和2D MC组之间的比较基因表达分析确定了425个差异表达基因，其中 357个下调，68个上调。此外，MCRT组在生物过程类别中与细胞外基质组织、细胞蛋白代谢、趋化性和免疫系统过程相关的基因中表现出最显著的差异表达。这些发现表明各种功能基因在这些情况下的协作作用。这归因于额外的TGF-β 和成纤维细胞分泌的 TGF-β 通过 TGF-β 信号通路对多个肿瘤细胞基因水平的调节作用，这些结果为阐明异质性复杂肿瘤微环境中的肿瘤耐药、转移和恶化提供了研究平台和理论基础。

 

高通量药物筛选

为了评估该异质性肿瘤微环境模型对药物筛选的有效性，进行了高通量细胞毒性评估，以研究肿瘤细胞的药物敏感性。结果表明，在不同微环境中与各种药物孵育的肿瘤细胞在细胞毒性方面表现出显着差异，尤其是在MCRT组中，对相同药物的敏感性降低，表明成纤维细胞介导的异质微环境增强了肿瘤细胞耐药性。这些初步发现验证了本研究中开发的肿瘤模型在指导药物评估和阐明疾病机制方面的有效性。用于药物评价和耐药性研究的体外肿瘤微环境的创新构建有望在该领域取得更广泛的应用和进步。

总结

在这项研究中，成功构建了一个成纤维细胞介导的3D异质性肿瘤微环境，该微环境复制了与真实生理环境一致的各种生物学特征，包括缺氧、炎症因子表达和上皮-间质转化（EMT） 转化。高通量 mRNA 测序数据分析揭示了3D培养环境和与CAF（MC和MCRT组）共培养在调节肿瘤细胞基因表达中的关键作用。此外，该模型通过对各种化疗药物的高通量筛选证明了肿瘤模型与药物疗效之间的复杂异质性。这种 3D异质性肿瘤微环境模型验证了使用生物3D打印技术构建体外肿瘤模型的潜力，为肿瘤发病机制提供了见解并指导治疗干预。